Российская наука, образование и перспективы.

	Yuri Rus ( Слушатель )
	23 мар 2010 05:05:43

Тред №200484

новая дискуссия Дискуссия 738

Насчет лженауки. Никто и никогда меня в этом не обвинял, но приведу пример именно со своим изобретением, для наглядности.Итак, в конце 90-х я изобрел определенную технологию клонирования ДНК в плазмиды, которую через некоторое время запатентовал. За свой счет (получены патенты США, Европы, Австралии и Канады; в остальных странах не подавал, дорого). Я единственный автор и правообладатель. Поскольку денег у меня на внедрение в тот момент не было, я контактировал ряд американских компаний и в итоге продал эксклюзивную лицензию одной из них. Преимущества моей технологии звучали довольно фантастически и они на самом деле мне не очень верили, даже когда я в их лаборатории продемонстрировал им, как она работает. Они потребовали самостоятельной проверки без моего участия. Проверили, по моим детальным инструкциям. Убедились, что я не вру и не преувеличиваю. У них буквально глаза на лоб полезли и они стали создавать наполеоновские планы по завоеванию рынка genomics и proteomics (и планы эти были вполне реальны). Менеджер, чья инициатива была купить у меня лицензию, получил титул Vice President of Genomics & Proteomics (отмечу, что компания была отнюдь не мелочь, в ней работало более 2000 человек, для биотех индустрии это много). Однако буквально через пару месяцев эта компания была куплена их главным конкурентом, который уже имел патентованную технологию клонирования и был лидером на этом рынке. Новое начальство же решило не инвестировать деньги в развитие моей технологии клонирования - зачем, они и так лидер в этой нише. Почти все сотрудники первой компании были уволены. Думаю, что менеджеры второй компании просто не поняли, что они получили. Я ждал несколько лет, в итоге мы согласились прекратить действие лицензии и все права вернулись ко мне. Я решил сам, за свой счет (на те не очень большие деньги, что я получил от лицензии) создать компанию и коммерциализировать эту технологию. До сих пор, моя компания не имеет достаточно денег, чтобы по-настоящему стать на ноги. Still struggling, но да ладно.Все другие методы клонирования обладают следующими недостатками:- Эффективность клонирования чудовищна низка - только одна молекула ДНК из десятков и сотен тысяч продуцирует колонию бактерий, содержащую плазмиду с инсертом.- Сильная селекция на короткие фрагменты ДНК, тогда как длинные фрагменты очень трудно клонировать.- Многие фрагменты ДНК вообще не хотят клонироваться, особенно содержащие прямые и инвертированные повторы.- Имеется высокий фон плазмид без нужного инсерта или с делециями в инсерте.Биологи, занимающиеся клонированием, к этим недостаткам просто привыкли, и считают, что так и должно быть.Теперь сравним с моей технологией:- Эффективность клонирования почти 100% - почти 100% инсертов продуцируют кольцевые плазмиы с инсертами, которые трансфицируют компетентные клетки с такой же эффективностью, как и суперскрученные плазмиды (пардон за терминологию, понятную лишь биологам). - И короткие, и длинные фрагменты ДНК клонируются с равной эффективностью - нет никакой селекции. - Клонируются практически любые фрагменты ДНК - и с прямыми/инвертированными повторами, и токсичные для клеток.- Фон плазмид без инсертов или с делециями практически отсутствует (в тысячи раз меньше, чем с клонированием внутрь токсичного для бактерий гена, как у плазмиды pZero).- Это все позволяет клонировать субфемтограммные количества ДНК - фактически единичные копии молекул ДНК (единственным ограничением является эффективность трансфекции/электропорации).Итак. Вы не забыли, что моя технология запатентована? Так вот - хотя патент весьма убедительно описывает метод клонирования, который действительно лучше всех альтернатив, на самом деле, в нем не описаны некоторые ноу-хау. Trade secrets. Без которых - воспроизвести эффективность моей технологии невозможно. Когда я продал лицензию на эту технологию, я раскрыл покупателям только часть этих ноу-хау, без которых она бы у них просто не работала. Она у них работала - но очень коротко, пока их всех не уволили. Так что они об этом давно забыли (я полагаю, основываясь на том, что никто до сих пор не выпустил на рынок метод клонирования с даже в сотни раз меньшей эффективностью, чем мой).Вот только о наших возможностях пока мало кто знает - по простой причине отсутствия достаточных денег. Я пишу это не с целью найти инвесторов - пока что, я надеюсь, что деньги у нас все же появятся. Заработаем.Так вот, возвращаясь к теме лже-науки и соответствующей комиссии РАН: как вы думаете, какова будет реакция данной комиссии, если я заявлю, что весь мир - и биологи РАН - шагают не в ногу, а я один в ногу? Даже если я продемонстрирую любому институту РАН свою технологию, даже если я дам им кит со своей плазмидой, буферами, ферментами и детальными инструкциями - и они независимо подтвердят, что мой метод работает с заявленной эффективностью? Но при этом я откажусь раскрыть им свои ноу-хау? Я очень сильно подозреваю, что они или вообще откажутся это рассматривать, или объявят это лже-наукой. А раскрывать я в данный момент - не готов. Это стоило мне слишком много нервных сил и лет жизни.

Отредактировано: Yuri Rus - 18 мар 2022 22:51:33

+0.00 / 0

АУ

ОТВЕТЫ (17)

	kinvel ( Слушатель )
	23 мар 2010 11:44:11

Цитата: Yuri Rus от 23.03.2010 05:05:43

- Эффективность клонирования чудовищна низка - только одна молекула ДНК из десятков и сотен тысяч продуцирует колонию бактерий, содержащую плазмиду с инсертом

Клонирование бывает разное, и эффективность разная. Так что в общем утверждение неверно. Существование универсального метода повышения эффективности до 100% вызывает сомнение.

- Сильная селекция на короткие фрагменты ДНК, тогда как длинные фрагменты очень трудно клонировать.

BAC

- Многие фрагменты ДНК вообще не хотят клонироваться, особенно содержащие прямые и инвертированные повторы.

Бывает, нечасто.

- Имеется высокий фон плазмид без нужного инсерта или с делециями в инсерте.

Без вставки и делеции - это разные явления. Если первое возникает чаще всего от кривых рук, то второе - как правило особенности продукта, зависящие в основном от систем рекомбинации штамма-хозяина плазмиды.

А суть ноу-хау заключается в том, что ПОЧТИ ВСЕ методы даже не клонирования, а вообще работы с ДНК - неверны. Они разрушают ДНК (точнее, меняют ее нативную конформацию). Многое из этого было ранее описано биофизиками - но молекулярные биологи не читают заумные и непонятные статьи биофизиков и потому никто не применял этих знаний к клонированию или, скажем, к транскрипции ДНК, или к трансфекции плазмид в клетки млекопитающих - включая человеческие.

А вот такие вещи надо доказывать, причем публикациями в рецензируемых журналах.

В целом ваша заява, что никто кроме вас не умеет работать с ДНК, требует хотя бы некоторых доказательств, кроме ваших слов и только вам известных но-хау. Так что, "если директором был я", то с жульническим патентом, без публикаций и экспериментальных доказательств, шли бы вы лесом.

+0.00 / 0

АУ

	Yuri Rus ( Слушатель )
	23 мар 2010 13:02:34

Цитата: kinvel от 23.03.2010 11:44:11- Эффективность клонирования чудовищна низка - только одна молекула ДНК из десятков и сотен тысяч продуцирует колонию бактерий, содержащую плазмиду с инсертомКлонирование бывает разное, и эффективность разная. Так что в общем утверждение неверно. Существование универсального метода повышения эффективности до 100% вызывает сомнение.Если ограничиться клонированием только в плазмиды и не брать, скажем, фаг лямбду, то все методы клонирования, кроме моего, имеют именно что очень низкую эффективность. Для примера: типичная реакция клонирования использует нанограммы или даже десятки нанограмм инсерта (возьмем, для конкретности, 5 нг 1 кб ПЦР продукт с тупыми концами), а число колоний, опять таки в типичном случае, будет от нескольких десятков до нескольких тысяч. Я же, в типичном, опять-таки случае (используя хим. компетентные клетки с эффективностью 10⁹ колоний/мкг суперскрученной плазмиды), получаю 500 колоний, все с правильными инсертами, при использовании 1 пикограмма 1 кб ПЦР продукта с тупыми концами. Используя же 1 пикограмм 10 кб ПЦР продукта с тупыми концами, получаю 50 колоний, все с правильными инсертами. Если же мы делаем электропорацию с электро-компетентными клетками (10¹⁰ колоний/мкг), то получаем, соответственно, в 10 раз больше колоний с инсертами. При этом, эффективность клонирования рестрикционных фрагментов с тупыми концами в 6 раз выше, чем для ПЦР продуктов. Сомнения ваши неудивительны - потому что никто этого не сможет сделать (кроме меня).- Сильная селекция на короткие фрагменты ДНК, тогда как длинные фрагменты очень трудно клонировать.BACВАС тут ни при чем. Да, ВАС позволяет клонировать длинные фрагменты, как и лямбда, и космиды, но речь-то о том, что при клонировании в плазмиду эффективность клонирования длинных фрагментов во много раз меньше, чем эффективность клонирования коротких фрагментов. Вы понимаете разницу: используя мой метод, можно проклонировать 50 кб с той же эффективностью, как и 10 кб, как и 1 кб, как и 100 бп (разумеется, при одинаковой молярности, а не молекулярном весе)? Посмотрите выше - с какой эффективностью: единицы фемтограмм (для справки, поскольку фемто практически не используется в биологии - это 10^-15, то есть в 1000 раз меньше пико).- Многие фрагменты ДНК вообще не хотят клонироваться, особенно содержащие прямые и инвертированные повторы.Бывает, нечасто.Да? А Вы в курсе, насколько трудно клонировать, скажем, центромерные и теломерные области генома? И что до сих пор человеческий геном не просеквенирован полностью?- Имеется высокий фон плазмид без нужного инсерта или с делециями в инсерте.Без вставки и делеции - это разные явления. Если первое возникает чаще всего от кривых рук, то второе - как правило особенности продукта, зависящие в основном от систем рекомбинации штамма-хозяина плазмиды.На самом деле - открою Вам секрет - и без вставки, и с делециями это одно явление. Отсутствие инсерта обычно определяют по белым/синим колониям (если такая возможность есть, так как далеко не все плазмиды эту селекцию имеют). Так вот, если Вы просеквенируете какое-то число синих колоний, Вы обнаружите, что многие из них имеют короткие делеции или инсерты, сохраняющие reading frame (пардон, забыл как - рамку считывания?), в сайте клонирования. Это результат той самой "порчи" ДНК. Но детали я объяснить не могу, сожалею. Не спрашивайте. Насчет кривых рук - это не так. Возьмите те самые 5 нг 1 кб фрагмента и, скажем, 10-20 нг дефосфорилированной (или с топоизомеразой, неважно) плазмиды c LacZ геном. Возьмите также эту же плазмиду без инсерта (контроль). Клонируйте и трансфицируйте все количество. В ОБОИХ случаях, Вы обязательно будете иметь довольно много синих колоний, а в случае контроля, также некоторое количество белых колоний. Если же используете очень маленькое количество инсерта - скажем, 1 пикограмм, а затем просеквенируете все белые колонии, то обнаружите почти исключительно фон с делециями. Нужного же Вам инсерта почти не будет. Когда я продемонстрировал мой метод той самой компании, и они захотели сравнить его (без моего участия) с другими методами клонирования (основными, в частности Торо-клонирование в pZero), они обнаружили, что фон у моего метода был в несколько сот раз меньше, чем у Topo-cloning into pZero, и во много тысяч раз, чем у стандартных методов (с лигированием и без клонирования внутрь токсичного гена).

Цитата: kinvel от 23.03.2010 11:44:11

Доказательства у меня ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ. Продемонстрированные ряду компаний, которые повторили это и без моего участия. Публиковать я буду только конечные результаты клонирования - гены и библиотеки - но не все детали метода клонирования. Именно этот конечный продукт и является требуемым научным или коммерческим результатом. Вас интересует такой-то палиндромный или токсичный ген? Пожалуйста - сделайте заказ и мы его для Вас проклонируем. Даже можем просеквенировать. В чем проблема?

+0.00 / 0

АУ

	kinvel ( Слушатель )
	23 мар 2010 15:11:32

Цитата: Yuri Rus от 23.03.2010 13:02:34

Что вы так волнуетесь? Сами же черным по белому написали, что в описании патента опустили критические для воспроизведения метода детали. И как это назвать?

Хорошо, есть у вас метод эффективного клонирования, который вы не хотите публиковать, несмотря на то, что у вас есть патент, т.е. при коммерческом использовании необходимо будет приобрести лицензию. Стало быть, вы хотите иемть доходы и с некоммерческого использования (т.е. использования в чисто исследовательских целях). В принципе это законно, однако не считается комильфо. Это во-первых.

Во-вторых, ИМХО, вы несколько переоцениваете необходимость такого метода. Геномы уже несколько лет секвенируют без всякого клонирования (про пиросиквенсинг, надеюсь, знаете?). То же и с массированным секвенированием транскриптомов. Репрезентативные библиотеки кДНК? Ну наверное где-нибудь нужны, в метагеномике может быть или еще где... Тут вы опоздали лет на 20. Клонирование фемтограммовых количеств? Тут теплее, single cell transcriptome без ПЦР вещь полезная, хотя придется доказывать, что репрезентативность сохраняется при клонировании лучше, чем при хитрых ПЦР. Дык опубликуйте метод, все будут вам благодарны, будет слава и гранты. Но так вам почему-то не надо... Непонятно.

Публиковать я буду только конечные результаты клонирования - гены и библиотеки - но не все детали метода клонирования. Именно этот конечный продукт и является требуемым научным или коммерческим результатом. Вас интересует такой-то палиндромный или токсичный ген? Пожалуйста - сделайте заказ и мы его для Вас проклонируем. Даже можем просеквенировать. В чем проблема?

Не пойдет. Вот например, мне надо получить библиотеку из очень малых количеств ДНК. Причем я заранее не знаю, что там будет. Извините, заказывать кому-то сделать это неизвестным никому методом я не стану. Лучше сделаю ПЦР, несмотря на возможное ухудшение репрезентативности.

+0.00 / 0

АУ

	Yuri Rus ( Слушатель )
	23 мар 2010 15:59:30

Цитата: kinvel от 23.03.2010 15:11:32
Что вы так волнуетесь? Сами же черным по белому написали, что в описании патента опустили критические для воспроизведения метода детали. И как это назвать?

Хорошо, есть у вас метод эффективного клонирования, который вы не хотите публиковать, несмотря на то, что у вас есть патент, т.е. при коммерческом использовании необходимо будет приобрести лицензию. Стало быть, вы хотите иемть доходы и с некоммерческого использования (т.е. использования в чисто исследовательских целях). В принципе это законно, однако не считается комильфо. Это во-первых.

Очевидно, есть некое непонимание. Метод клонирования мной был опубликован - в патенте. Ноу-хау же относятся не к этому только методу, но вообще к любому методу клонирования. Я могу получить почти такую же эффективность, как с моим патентованным методом, и с любым другим методом клонирования. Например, с методом стандартного лигирования плазмиды и инсерта. С методом клонирования в фаг лямбда, в ВАС. С Торо-клонированием. С чем угодно. Более того - это не есть ноу-хау, применимые только к клонированию. Они относятся к любым манипуляциям с ДНК. Я упоминал выше о транскрипции, о трансфекции в клетки (что имеет значение не только для исследований, но и в медицине и в создании генномодифицированных растений и животных). Что угодно - ELISA, например. Везде, где используются ДНК - и РНК, кстати (in vitro трансляция, скажем). Эффективность всех этих методов возрастает многократно.

Во-вторых, ИМХО, вы несколько переоцениваете необходимость такого метода. Геномы уже несколько лет секвенируют без всякого клонирования (про пиросиквенсинг, надеюсь, знаете?). То же и с массированным секвенированием транскриптомов. Репрезентативные библиотеки кДНК? Ну наверное где-нибудь нужны, в метагеномике может быть или еще где... Тут вы опоздали лет на 20. Клонирование фемтограммовых количеств? Тут теплее, single cell transcriptome без ПЦР вещь полезная, хотя придется доказывать, что репрезентативность сохраняется при клонировании лучше, чем при хитрых ПЦР. Дык опубликуйте метод, все будут вам благодарны, будет слава и гранты. Но так вам почему-то не надо... Непонятно.

"Секвенирование без всякого клонирования" - есть манипуляции с ДНК. См. выше - эффективность повышается многократно. Репрезентативные библиотеки кДНК нужны, прежде всего, для того, чтобы просеквенировать все эти кДНК, то есть, объясняю очевидную вещь, получить кодируемые последовательности белков. Если вы имеете только, в лучшем случае, процентов 70 от всех кодируемых последовательностей (большинство длинных кДНК у вас отсутствуют или присутствуют в урезанной форме), то вы о геноме данного организма знаете очень мало. Знание геномной ДНК для данных кДНК вам не дает возможности их предсказать, особенно учитывая альтернативный сплайсинг.

Опоздал лет на 20? Вы считаете, что работать с ДНК и РНК больше не нужно?

Опубликовать могу, но по ряду причин не хочу. Гранты я и сейчас мог бы получать, но - просто не хочу тратить на написание время. Кстати, гранты есть не только NIH и вообще научные, есть и куча грантов для создания small бизнесов. Тоже мог бы получить - но ненавижу писать аппликации.

Публиковать я буду только конечные результаты клонирования - гены и библиотеки - но не все детали метода клонирования. Именно этот конечный продукт и является требуемым научным или коммерческим результатом. Вас интересует такой-то палиндромный или токсичный ген? Пожалуйста - сделайте заказ и мы его для Вас проклонируем. Даже можем просеквенировать. В чем проблема?

Не пойдет. Вот например, мне надо получить библиотеку из очень малых количеств ДНК. Причем я заранее не знаю, что там будет. Извините, заказывать кому-то сделать это неизвестным никому методом я не стану. Лучше сделаю ПЦР, несмотря на возможное ухудшение репрезентативности.

Цитата: kinvel от 23.03.2010 15:11:32

Да будете заказывать, куда Вы денетесь. Через несколько лет. Когда всем будет известно, и многократно подтверждено, что эффективность моих методов в тысячи раз лучше, чем у всех остальных. Я же не предлагаю Вам делать заказы сейчас. Такие единичные заказы я и не приму сейчас.

Как бы, для иллюстрации. Представьте себе, что ПЦР не был запатентован и никто более не догадался до этого метода. Но есть компания, которая, как всем известно, применяет какой-то очень эффективный метод для мультипликации ДНК. И постепенно все большее число компаний и академических ученых начинают делать ей заказы. И получают продукты ПЦР. Могут ли себе позволить какие-то компании или ученые НЕ ДЕЛАТЬ заказов на ПЦР, с обоснованием, мы-де не знаем, как это делается? Вначале - да, могут. А потом?

В общем, возврат к средневековью. Секреты мастеров, которые умерли с ними. Время, когда не было патентов и интеллектуальной собственности. Меня, кстати, это отнюдь не радует и я был бы рад это опубликовать и сделать доступным для других. Но не могу. Причин много и я сейчас о них не хочу говорить. Во всяком случае, дело совершенно не в жадности и не в желании все загрести под себя. Как раз наоборот.

+0.00 / 0

АУ

	kinvel ( Слушатель )
	23 мар 2010 16:20:57

Цитата: Yuri Rus от 23.03.2010 15:59:30

В воздухе запахло волновым геномом. Сорри, вопросов больше нет.

+0.00 / 0

АУ

	Мы c Преведом ( Слушатель )
	23 мар 2010 19:41:21

Цитата: Yuri Rus от 23.03.2010 15:59:30

Хм. Был (есть) у меня знакомый. Примерно в 1992-м он всем рассказывал, что создал супер-пупер движок 3-х мерной графики, и им заинтерисовался Сименс, и что "через пару лет я, наверное, стану миллионером" (небольшой сумасшедшинкой от него веяло всегда). Под 70 ему, так и живет в общаге. Он и впрямь чего-то там написал. Но - "время одиночек прошло" (c)
Мое убеждение - сегодня человек в одиночку не в состоянии осуществить прорыв в науке. Но успехов Вам.

+0.00 / 0

АУ

	kinvel ( Слушатель )
	23 мар 2010 20:28:07

Цитата: Мы с Преведом от 23.03.2010 19:41:21

Да нет, вполне в состоянии: http://en.wikipedia.org/wiki/Kary_Mullis

Только вот эти одиночки не ведут себя, как подпольщики на допросе в Гестапо. Что и вызывает в нашем случае некоторые сомнения....

+0.00 / 0

АУ

	Yuri Rus ( Слушатель )
	24 мар 2010 01:05:25

Цитата: kinvel от 23.03.2010 20:28:07

Вы понимаете разницу между академической наукой и научным бизнесом? О роли ноу-хау и торговых секретов для хай-тек компаний когда-нибудь слышали? О том, что сложные технологии практически всегда включают в себя незапатентованные ноу-хау, из-за которых, собственно, другие компании часто и вынуждены честно платить за лицензии (после того, как, помучившись с воспроизведением и reverse-engineering, так и не добиваются сравнимого качества)? Вот зайдите хотя бы на военные ветки, там постоянно упоминаются примеры российских военных технологий, которые Китай пытался скопировать, но в итоге был вынужден заплатить за лицензию.

+0.00 / 0

АУ

	Yuri Rus ( Слушатель )
	24 мар 2010 00:56:24

Цитата: Мы с Преведом от 23.03.2010 19:41:21

"Время одиночек прошло" - любимое выражение середнячков в науке. Прорывы ВСЕГДА совершаются одиночками. Принципиально новые идеи ВСЕГДА приходят в голову одному конкретному человеку, а не огромному коллективу сотрудников. Если речь идет дейсивительно о революции в науке, а не об очередном маленьком шажке вперед.

+0.00 / 0

АУ

	Рома Кошелкин ( Слушатель )
	24 мар 2010 01:02:07

Цитата: Yuri Rus от 24.03.2010 00:56:24

Прорывные идеи приходят в голову одному но при этом он опирается на черновую работу всего коллектива.
Если же человек вдруг приходит в какую то область и тут же "решает" глобальную задачу, то скорее всего его "открытию" самое место в комиссии по лженауке :)

+0.00 / 0

АУ

	Yuri Rus ( Слушатель )
	24 мар 2010 01:39:30

Цитата: Рома Кошелкин от 24.03.2010 01:02:07

Любой ученый всегда опирается на работу других ученых. Но при этом не обязательно тех, кто работает вместе с ним, в одной лаборатории или компании. Я, кстати, упомянул, что в моих ноу-хау я опирался прежде всего на работы биофизиков, которые просто были не известны мол. биологам и тем более не осмыслены ими. Биологи просто недостаточно знают математику, чтобы читать работы биофизиков. Я же, по первому своему образованию, инженер-электрофизик (окончил ФТФ НЭТИ, ныне НГТУ), так что математика меня не пугает. И вообще я начинал в биологии с теоретической генетики (опубликовал в Генетике и Успехах Современной Биологии 4 альтернативных теории онтогенеза, старения и рака, единственный автор на всех статьях, легко найти - это к слову о том, что кто-то пришел в новую область и сразу решает глобальную задачу; если Вы понимаете смысл термина "теория онтогенеза"). Потом уже стал заниматься экспериментами - для проверки своих теорий и гипотез. И потом уже стал изобретать новые технологии - которых у меня к настоящему времени уже достаточно большое количество. И упомянутая технология клонирования ДНК, с сопровождающими ноу-хау, даалеко не самая важная из них. Я про нее упомянул только в связи с возможной реакцией Комиссии по лже-науке на нее, если бы я, паче чаяния, попытался получить финансирование от РАН или каких-либо других органов РФ. При этом, в США ни у кого не возникает вопросов, когда я говорю, что вот есть запатентованная технология - смотрите описание. Специалистам понятно, что это должно работать лучше других методов уже из этого описания (потому что эта технология представляет из себя всего лишь новую комбинацию нескольких других широко используемых методов, каждый из которых работает с почти 100% эффективностью). Но у меня есть также другие методы, которые я не раскрываю, - ноу-хау, которые дополнительно многократно увеличивают эффективность технологии. Американцам это все вполне понятно - бизнес есть бизнес, какой же хай-тек будет раскрывать все свои технологические секреты. Так именно что ВСЕ ДЕЛАЮТ.

Экстраполируя эту ситуацию, я задаюсь вопросом, не может ли быть, что пресловутая Комиссия объявила лже-наукой какие-то технологии, авторы которых просто не хотели раскрыть всех своих ноу-хау (по вполне legitimate business reasons)? Я могу продемонстрировать эффективность своей технологии сам или могу дать кит с протоколом на проверку любому другому ученому или организации. Я даже не боюсь того, что кто-то проведет скрупулезнейшие хим. анализы компонентов моего кита - это все равно не даст ему информации, как это было получено. Любой ученый может взять свой собственный, скажем, продукт ПЦР, или синтезировать кДНК, или приготовить геномную ДНК - без моего участия. Затем взять мой кит, провести клонирование, следуя протоколу, - и проанализировать результаты. Всё - других доказательств не должно требоваться.

Но вот согласится ли Комиссия с тем, что их не должно требоваться?

+0.00 / 0

АУ

	Рома Кошелкин ( Слушатель )
	24 мар 2010 02:04:36

Цитата: Yuri Rus от 24.03.2010 01:39:30

Если ученый опирается на общдоступные во всех деталях работы других, то что мешает сделать то же самое кому либо еще?
Вот и получается что все что лежит "на поверхности" уже открыто, а для более глубоких исследований требуется планомерная работа целой школы.
Возможно в вашем случае вы действительно оказались первым.

Цитата: Yuri Rus от 24.03.2010 01:39:30

Думаю что комиссия в первую очередь смотрит на предмет противоречия хорошо установленным законам природы.
Ноу-хау это ведь в первую очередь детали, а не некие общие принципы.
С другой стороны если кто то собщает о "секретном микроскопе Петрика" то это конечно же лже-наука.

+0.00 / 0

АУ

	Yuri Rus ( Слушатель )
	24 мар 2010 02:23:23

Цитата: Рома Кошелкин от 24.03.2010 02:04:36

Про Петрика я просто почти ничего не знаю - ну, прочитал несколько статей о нем. На мнение других я в таких случаях не полагаюсь, а чтобы составить свое, потребуется потратить слишком много времени. А поскольку то, чем он занимается, меня не интересует, то времени жалко. Вполне возможно, что шарлатан. Но не обязательно - сам ведь я с его установками дела не имел, да даже и не читал о них детально. Если бы я мог поставить с ними эксперименты, тогда только сформировал бы свое мнение.Ноу-хау же мои, вышеупомянутые, в большинстве своем основаны на работах, опубликованных другими. Я просто единственный, кто смог их осмыслить и применить к рутинной работе с ДНК. Но ноу-хау этих, на самом деле, довольно много и независимо догадаться до них всех - почти невозможно. Есть, скажем, примерно 20 "нельзя": нельзя использовать такой-то компонент реакции или такую-то температуру и т.п. Каждое из этих "нельзя", вроде бы, мелочь. Не "высокая наука". Просто в качестве примера, для конкретности (хотя это далеко не самое важное "нельзя"): если ДНК преципитировать с этанолом, центрифугировать и затем осадок отмыть от соли 70%-м этанолом, то при этом сначала испаряется этанол, и только затем - вода. Какое-то время (а даже секунды для ДНК - более чем достаточно) ДНК будет в почти чистой воде и изменит свою конфигурацию, что на следующих этапах манипуляций приведет к трагическим последствиям. Следовательно, промывать надо смесью этанола не с чистой водой, а с некоторым содержанием соли - хотя бы ТЕ буфера. Вот из таких "мелочей" и состоят мои ноу-хау. И любая из них - критична.Эти ноу-хау отнюдь не самое главное мое достижение в науке - я об этом написал только в качестве примера того, что многие компании и бизнесмены могут иметь серьезные причины для того, чтобы не раскрывать публике или комиссиям по лже-науке все секреты своих технологий.Тем не менее, и на этом примере, можно задать вопрос: если все молбиологи ошибаются (не в принципах, а в методах своей науки) и зачастую получают ложные результаты, как часто это происходит в других науках? Практические применения: новые лекарства, новые породы животных, новые сорта растений - создаются с большой задержкой или вообще не создаются.Но жизнь при капитализме так устроена, что мне приходится в одиночку проламывать лбом стенку и тратить годы впустую, из-за нехватки финансирования. А опубликовать я эти ноу-хау, по многим причинам, не могу. В частности, это просто вопрос выживания. Не жадности.

+0.00 / 0

АУ

	kinvel ( Слушатель )
	24 мар 2010 12:35:44

"Выше упомянута история изобретения ПЦР: http://en.wikipedia.org/wiki/Kary_Mullis. Что мешало изобрести этот метод на 10-15 лет раньше?"

Если бы вы внимательно читали то, на что ссылаетесь, то узнали бы, что принцип ПЦР таки был предложен лет на 20 раньше в лаборатории Кораны. А мешало привести его в работающий метод две причины - отсутствие до начала 80-х надежных и рутинных методов олигонуклеотидного синтеза и отсутствие термостабильных полимераз (первая была получена С.И. Городецким также в начале 80-х).

"Для биологов же, к числу которых Вы, настолько я понимаю, не относитесь, я могу привести простые калькуляции, доказывающие, что все существующие методы клонирования в плазмиды действительно крайне неэффективны."

Что-то не нравятся мне эти калькуляции. Аттомоль средней плазмиды весит около 3 пикограмм, т.е. при 100% эффективности даст на лучших компетентных клетках около 300 колоний. И скока это будет в миллионы раз меньше?

А уж проблемы с клонированием ПЦР были решены 20 лет назад, когда выяснилось, что полимераза навешивает на концы дополнительные А.

+0.00 / 0

АУ

	Yuri Rus ( Слушатель )
	24 мар 2010 13:25:01

Цитата: kinvel от 24.03.2010 12:35:44

"Для биологов же, к числу которых Вы, настолько я понимаю, не относитесь, я могу привести простые калькуляции, доказывающие, что все существующие методы клонирования в плазмиды действительно крайне неэффективны."

Что-то не нравятся мне эти калькуляции. Аттомоль средней плазмиды весит около 3 пикограмм, т.е. при 100% эффективности даст на лучших компетентных клетках около 300 колоний. И скока это будет в миллионы раз меньше?

Смотря что вы называете средней плазмидой, какой длины, но да ладно. Пусть будет 3 пикограмма. Для лучших коммерческих хим. компетентных клеток эффективность 5х10⁹ CPU/ug плазмиды pUC19 (аттомоль несколько меньше 3 пикограмм). Для лучших коммерческих электро-компетентных клеток эффективность 2х10¹⁰ CPU/ug плазмиды pUC19, но если приготавливать клетки самому и не замораживать, а использовать свежими, то можно повысить до 5х10¹⁰ CPU/ug pUC19 (метод приготовления клеток опубликован - не мной - в Biotechniques лет 6 назад). Так что количество колоний несколько выше. Цифру 10^-18 моля я назвал из тех соображений, чтобы число колоний для суперскрученной плазмиды посчитать было реально. В миллион раз меньше будет, разумеется, ноль. В реальности, 3 пикограмма инсерта (длинней хотя бы 1 кб; не будем обсуждать очень короткие, типа 20-30 бп) клонировать почти невозможно - существующими методами. Точнее, при помощи всяческих ухищрений можно вымучить несколько колоний с инсертами, но найти их среди фона колоний без инсертов / с делециями ну крайне трудоемко - нужно секвенировать многие тысячи колоний. Сравнить эффективность клонирования инсерта с трансфекцией суперскрученной плазмиды можно, используя разбавленную раз в 1000 аликвоту суперскрученной плазмиды и полное количество плазмиды с инсертом. Именно так обычно и делают - если делают контроль на эффективность самой трансфекции/электропорации.

А уж проблемы с клонированием ПЦР были решены 20 лет назад, когда выяснилось, что полимераза навешивает на концы дополнительные А.

Цитата: kinvel от 24.03.2010 12:35:44

Я об этом упомянул ведь - ТА-клонирование. Я и говорю, что ПЦР продукты не могли клонировать только люди с кривыми руками. Но их было вплоть до середины 90-х гг. удивительно много - это не из моего опыта общения с людьми, а со слов представителей компаний, продающих такие киты для клонирования. Вы же понимаете, что мало кто сами делали векторы для ТА-клонирования, эти киты покупали? Но потом доминировать стали все-таки Торо-киты.

Тем не менее, когда Вы говорите, что проблемы с клонированием ПЦР продуктов были решены - переведите это утверждение в цифры. Вспомните или, когда будете ставить такой эксперимент, просто подсчитайте, сколько колоний даст некое молярное количество исходного суперскрученного вектора (1 аттомоль или 10, или 0.1 - неважно, лишь бы удобно было подсчитать колонии), а также сколько колоний даст равное молярное количество клонируемого ПЦР продукта. Разумеется, по чашке Петри Вы будете размазывать не равные их количества - иначе Вы или получите сплошной слой бактерий с суперскрученной плазмидой, или не увидите ни одной колонии с инсертом. Зато это легко пересчитывается (используйте в 10,000 или в 1,000,000 раз больше инсерта). Уверяю Вас, Вы увидите огромную разницу. И задумайтесь, что вся эта разница происходит из того, что лишь одна из 10,000 или 1,000,000 молекул инсерта дает колонию. Что и означает чудовищную неэффективность методов клонирования.

Мой метод же дает практически РАВНОЕ число колоний для суперскрученной плазмиды и для равномолярного количества инсерта. То есть эффективность почти равна 100%.

+0.00 / 0

АУ

	Yuri Rus ( Слушатель )
	23 мар 2010 16:25:53

Кстати, вспомнился забавный эпизод. Когда я демонстрировал мой метод той компании, я приготовил плазмиду и blunt-end рестрикционные фрагменты разной длины (от нескольких сотен бп до более 10 кб, всего 7 фрагментов) для контроля - для обычного лигирования в 20 мкм. Потом, когда они стали проверять метод без моего участия, они решили использовать, для быстроты, приготовленные мною плазмиду и фрагменты. Вдруг, неожиданно для себя, они получили такой результат, который никуда не вписывался: тогда как при использовании моего метода была абсолютно равная эффективность клонирования всех фрагментов разной длины, в контроле была сильная селекция НА ДЛИННЫЕ ИНСЕРТЫ! Они вызвали меня и спросили, что это значит?! Должно же быть, в контроле, ровно наоборот! Я им объяснил, что так и должно быть (теоретически): короткие фрагменты имеют намного бОльшую вероятность само-циркуляризации, чем длинные, до того, как один их конец прилигируется к плазмиде. Таким образом, большинство коротких фрагментов просто исключаются из реакции лигирования с плазмидой. Концы же длинных фрагментов требуют намного больше времени для того, чтобы они встретились и замкнулись в кольцо, поэтому они имеют больше шансов встретиться с концом плазмиды. А далее уже происходит циркуляризация плазмид-инсерт конструкта.Так они решили, что это они совершили такое открытие! И решили это запатентовать - без моего соавторства (которое мне на этом их патенте и даром не было нужно), поскольку, как они заявили, они же этот эксперимент с контролем поставили сами, без меня. Жадность фраера сгубила. Только потом до них дошло (я разъяснил), что этот результат - с преимущественным клонированием ДЛИННЫХ инсертов, они получили только потому, что инсерты и плазмиду для стандартного метода клонирования ПРИГОТОВИЛ Я. И что никакой новизны в такой патентной аппликации не было, и патент они бы не получили: потому что формально, по описанию, это именно что стандартный метод клонирования. Вот так.

+0.00 / 0

АУ

	Yuri Rus ( Слушатель )
	23 мар 2010 13:50:17

Цитата: kinvel от 23.03.2010 11:44:11

Еще раз, другими словами: потеря длинных ДНК и преимущественное клонирование коротких фрагментов имеет особое значение при создании библиотек кДНК. Надеюсь, не надо объяснять важность этого? Используемые сейчас методы В ПРИНЦИПЕ НЕ ПОЗВОЛЯЮТ создать репрезентативные библиотеки кДНК. При этом, не только длинные кДНК теряются, но и имеется селекция на клонирование коротких фрагментов кДНК, вместо кДНК полной длины.

Цитата: kinvel от 23.03.2010 11:44:11

Часто-часто. Когда первая версия человеческого генома была опубликована Селерой в 2000-м году, она включала в себя только 60 с чем-то процентов генома (точную цифру не помню, примерно 65%). При этом, просеквенировано Селерой было примерно 30 Гб (гигабэйз), то есть, теоретически, в 10 раз больше, чем геном человека (3 Гб). Эти 65% были самыми легкими для клонирования - большинство остальных фрагментов генома потребовали очень и очень многократного секвенирования, с прогрессивно уменьшающейся эффективностью, а ряд участков были клонированы только при помощи особых ухищрений. Например, при помощи YAC (Ларионов, NCI). Пусть не треть - но минимум четверть любой геномной ДНК эукариот трудно проклонировать. Особенно последовательности с повторами - такие как центромеры и около-теломерные области (сами теломеры, конечно, являются короткими повторами, но и прилегающие к ним области содержат много повторов), всякие транспозоны, GT-повторы, и пр.У бактерий ДНК содержит меньше повторов, поэтому сравнительно легко там можно проклонировать больший процент генома, чем у эукариот. Но значительная часть генома и у них трудно клонируема имеющимися методами.Так что это - далеко не пустяк.

+0.00 / 0

АУ

<< Тред №200483

Тред №200485 >>